Um dos principais objetivos do tratamento das doenças autoimunes é a supressão específica do processo imune autorreativo, sem que se afete o restante do sistema imunológico. Atualmente, as doenças autoimunes ainda são tratadas com drogas imunossupressoras de amplo espectro, que deixam os pacientes vulneráveis a infecções oportunísticas. 

Este desafio da prática clínica tem motivado a busca de novas opções. Pesquisas de alta tecnologia nesta área trouxeram muitos avanços, como o uso de anticorpos monoclonais ou peptídeos sintéticos desenhados para o bloqueio específico das células que iniciam e mantêm o ataque imunológico, mas estes recursos ainda representam alternativas complexas e dispendiosas. 

O fenômeno da tolerância imunológica é uma propriedade básica natural do sistema imune, que, ao discriminar entre o próprio e o não-próprio, atenua ou abole a resposta imune ativa a estruturas reconhecidas como inerentes ao organismo. A tolerância imunológica é adquirida durante a maturação do sistema imune, por mecanismos que deletam ou inativam clones de linfócitos antígeno-específicos.

Tolerância de mucosas é um processo imunológico induzido, em que a administração de determinado antígeno solúvel, via mucosas, induz um estado de hiporresponsividade a imunizações subsequentes com o mesmo antígeno inoculado por qualquer outra via. Como exemplo, este mecanismo permite que antígenos do Complexo Maior de Histocompatibilidade sejam ignorados quando apresentados na mucosa genital. Esta tolerância aos antígenos de histocompatibilidade é fundamental para o sucesso da reprodução sexuada.

A indução de tolerância por via oral se inicia com a apresentação do antígeno exógeno ao sistema imune periférico através do trato digestivo. Portanto, é uma forma de tolerância imunológica extra-tímica, induzida por antígenos que atenuam a resposta a proteínas imunogênicas previamente apresentadas à mucosa entérica. Dessa forma, se obtém importante supressão, tanto da resposta humoral quanto daquela mediada por células, após a administração do antígeno por via oral e subsequente imunização sistêmica com o mesmo antígeno.

A indução de tolerância por via oral, se efetiva nas doenças autoimunes humanas, seria uma maneira simples e barata de tratamento, constituindo uma alternativa vantajosa, inclusive porque o seu sucesso independe da identificação exata do epítopo antigênico causador da doença

Histórico sobre Tolerância Oral

Desde o início deste século, tem sido consistentemente demonstrado que a administração oral de determinado antígeno é capaz de reduzir a resposta imune a este antígeno, quando doses subsequentes são administradas subcutaneamente. Dentre os vários estados de tolerância imunológica induzidos experimentalmente, um dos primeiros descritos na literatura foi obtido, exatamente, através da administração de antígenos pelo trato gastrointestinal.

Em 1829, Dakin relatou a observação de que índios que bebiam chás de folha de "aroeirinha" não mais desenvolviam a reação pruriginosa resultante do contato da pele com esta folha (1). Em 1911, o fenômeno foi descrito com mais detalhes por Wells (2), que obteve a prevenção da anafilaxia sistêmica em cobaias às quais proteínas do ovo de galinha haviam sido previamente administradas por via oral. Na mesma época, achados semelhantes foram encontrados com a zeína, uma proteína específica do milho (3). Em 1946, Chase demonstrou que se poderia suprimir respostas de sensibilidade ao contato em cobaias, através da alimentação com o hapteno DNCB (Dinitroclorobenzeno) (4). Esta supressão era específica, diminuindo a formação de anticorpos e abolindo a reação de hipersensibilidade tardia. Do exposto, pode-se concluir que a observação de atenuação da resposta imunológica a antígenos administrados por via oral é anterior à era da imunolgia moderna. 

Cerca de 20 anos depois, Thomas e Parrot (5) descreveram o fenômeno da tolerância oral para antígenos proteicos mais complexos, como albumina sérica bovina (BSA). Eles demonstraram que administrações repetidas desta proteína diminuiam a formação subsequente de anticorpos dirigidos contra a mesma. Estendendo estes conceitos, Andre e colaboradores (6) observaram que múltiplas administrações intragástricas de hemácias de carneiro em camundongos aboliam a resposta imunológica à imunização intraperitoneal subsequente. Da mesma forma, Vaz e colaboradores (7) obtiveram intenso e duradouro estado de tolerância imunológica à ovoalbumina (OVA) após uma única dose intragástrica desta proteína. 

Desde então, a indução de tolerância oral tem sido estudada para vários antígenos, em diversas espécies animais, com diferentes doses, usando administrações orais que precedem ou sucedem o desafio imunológico sistêmico. Presentemente, estão em andamento os primeiros estudos de tratamento de doenças autoimunes em humanos, como Artrite Reumatóide (8), Uveoretinite Autoimune (9), Esclerose Múltipla (10,11), Diabetes (12) e Tiroidite autoimune (13), utilizando os fundamentos do processo de tolerância oral explorados em modelos animais.

Administração Oral de Antígenos e Imunidadade do Sistema Gastrointestinal

Embora a presença de linfócitos na mucosa e submucosa do trato gastrointestinal seja conhecida há muitas décadas, a idéia de um sistema imunológico especializado próprio das mucosas é relativamente nova. Como a pele, o epitélio mucoso representa uma barreira entre o meio externo e o interno e, por isso, constitui uma importante linha de defesa do organismo.

A resposta imunológica a antígenos administrados por via oral é fundamentalmente diferente da clássica resposta a antígenos encontrados em outros sítios. As duas principais diferenças estão nos altos níveis de produção de IgA pelos tecidos mucosos e no favorecimento à tolerância do linfócito T, ao invés de sua ativação. 

O tecido linfóide das mucosas participa da defesa do hospedeiro através de sua extensa superfície, em contínuo contato com o ambiente externo. Este tecido contém estruturas linfóides especializadas que albergam células imunorreguladoras precursoras de linfócitos B e de linfócitos T, as quais determinarão indução de tolerância, ou intensa resposta imunológica, após a administração oral de um antígeno.

Estudos mais recentes têm sugerido que respostas imunossupressoras tipo T-2 helper (TH2) são geradas preferencialmente nas Placas de Payer, onde as células T se dividem em subtipos produtores de IL-5, IL-10 e, possivelmente, TGF-beta (14). 

Mecanismos de Tolerância Oral

São três os mecanismos básicos implicados na tolerância induzida por antígeno: deleção clonal, anergia clonal e supressão ativa. A deleção clonal, ou apoptose de células efetoras, é o mecanismo pelo qual clones de linfócitos são eliminados, por morte celular, ao entrarem em contato com o antígeno. A anergia clonal é um processo em que clones antígeno-específicos são funcionalmente inativados, mas não destruidos. Dentre os vários mecanismos de anergia, destaca-se aquele onde o linfócito deixa de expressar o receptor para o antígeno e aquele onde ocorre um bloqueio a nível do receptor, não permitindo que o antígeno se ligue a este. Finalmente, a supressão ativa representa a circunstância em que os clones de linfócitos passam a não mais responder frente a uma estimulação antigênica, devido à secreção in situ de linfocinas inibidoras, tais como IL-4, IL-10 e TGF-beta, produzidas por outros linfócitos.

O primeiro fator que determina a forma de tolerância que se desenvolve após a administração oral do antígeno é a quantidade administrada. Baixas doses de antígeno favorecem o mecanismo de supressão ativa, enquanto altas doses parecem favorecer anergia/deleção. Por sua vez, antígenos de baixo peso molecular e hidrossolúveislevariam a anergia/deleção, enquanto antígenos de maior peso molecular e lipossolúveis induziriam supressão ativa (15). 

Altas doses de antígeno administradas por via oral parecem resultar em apresentação sistêmica do antígeno. Após a passagem do antígeno pelo intestino, este ganha a circulação como proteína intacta ou como fragmento antigênico. O fato de não haver, ou haver pouca, supressão ativa com altas doses de antígeno por via oral ainda não está bem esclarecido nos diversos modelos experimentais.

O mecanismo de imunossupressão pode ainda variar com as características específicas do modelo estudado. Por exemplo, no modelo experimental de encefalite autoimune em ratos, as células T CD8⁺ estão implicadas na produção de um sinal supressivo (16), enquanto no mesmo modelo, mas em camundongos, as células T CD4⁺ são as responsáveis pelo processo de tolerância (17). 

O sinal supressivo produzido por estas células parece ocorrer, como citado acima, através da secreção de citocinas imunossupressoras, incluindo a IL-4, IL-10 e TGF-beta (17). Estas citocinas são secretadas por umsubgrupo de células T, denominadas TH2. A secreção destas citocinas produzem "supressão bystander" antígeno-inespecífica de qualquer resposta imune local (18). A forma pela qual o antígeno é apresentado no intestino também parece crucial para a geração da supressão ativa. Possivelmente, estas células estimulam preferencialmente respostas tipo TH2, devido ao microambiente intestinal ou às diferentes propriedades estimuladoras da célula apresentadora de antígeno.

A "supressão bystander " foi inicialmente demonstrada in vitro, onde se observou que células de animais alimentados com proteína básica da mielina (PBM) poderiam suprimir a proliferação de uma linha de células T reagentes à ovoalbumina, quando dispostas em vizinhança nas placas de cultura de células cujos poços fossem divididos por uma membrana (18). Somente após reestimuladas in vitro com o mesmo antígeno administrado por via oral, as células de animais alimentados com PBM foram capazes de suprimir a resposta imune vizinha, possivelmente através da secreção de um produto no sobrenadante das culturas, com capacidade de difusão transmembrana e com características inibidoras de proliferação celular. 

De maneira análoga, células de animais alimentados com OVA quando reestimuladas in vitro com este antígeno são capazes de suprimir um linhagem de linfócitos T reagentes à PBM, através do mesmo sistema transmembrana. Estes produtos mediadores têm sido identificados como citocinas imunossupressoras e, naquele experimento particular, o principal fator solúvel responsável pela supressão foi o TGF- beta. 

A interleucina 4 também parece participar do processo de imunossupressão como um fator regulador da geração de células TH2. Consistentes com esta hipótese são as observações de que a administração in vivo de IL-4 induz a produção de células secretoras de TGF-beta, protegendo camundongos do desenvolvimento de Encefalomielite Autoimune Experimental (17).

A apresentação do antígeno pelas células do Sistema Linfóide Intestinal induz, preferencialmente, a geração de células reguladoras. Estas células passam a secretar citocinas inibidoras, tanto in vivo quanto in vitro, após qualquer reconhecimento subsequente do antígeno.

Vários fatores podem interferir na geração destas células reguladoras. Dentre eles, destacam-se os fatores de co-estimulação, o microambiente no qual a resposta imune é iniciada e a geração preferencial de epítopos ditos imunogênicos ou tolerigênicos.

As respostas TH2 são também predominantemente geradas no intestino, através de células que secretam tanto IL-4 como IL-10. Estas células migram, então, para os orgãos linfóides, suprimindo a resposta imune através da inibição da geração de células efetoras, e para os orgãos-alvo, suprimindo a doença autoimune através da liberação de citocinas antígeno-inespecíficas (supressão bystander). 

Inúmeras estudos têm demostrado a inequívoca participação do mecanismo de supressão ativa como um dos eventos primários associados à tolerância oral (17). Mais recentemente, anergia clonal tem igualmente sido implicada (19,20), mas ainda há poucas evidências na literatura de que antígenos administrados por via oral induzam o fenômeno da deleção clonal (21).

Modelos Experimentais e Estudos em Humanos 

Tratamento de Doenças Autoimunes com Tolerância Oral em Modelos Animais 

Extensa documentação em doenças autoimunes, clínica e experimental, demonstra o sucesso dos estudos de tolerância oral. Em modelos animais, a indução de tolerância depende de vários fatores, tais como concentração, qualidade, frequência e estado físico do antígeno administrado, assim como idade dos animais utilizados. Tem-se, igualmente, constatado que os mecanismos, mediante os quais células T são induzidas à tolerância, são semelhantes aos descritos inicialmente para antígenos exógenos e envolvem supressão, deleção ou anergização destas células.

Os modelos animais nos quais o princípio de tolerância oral foi aplicado com sucesso e os respectivos antígenos empregados são os seguintes: 

Encefalite Autoimune Experimental (Proteína Básica da Mielina) 

Vários estudos demonstraram a eficácia da administração oral dos antígenos da mielina tanto em camundongos como ratos. Nos dois modelos animais, altas doses de antígeno oral, induzem supressão por anergia celular , enquanto baixas doses aumentam a secreção no sítio inflamatório de TGF-beta, que inibe assim a progressão da doença (16,22).

Diabetes (Insulina, GAD)

Vários estudos tem demonstrado o retardo da progressão da doença e em alguns casos a prevenção do diabetes em camundongos diabéticos não-obesos (NOD mice). A imunohistoquímica de ilhotas pancreáticas dos animais tratados com tolerância oral (insulina ou GAD) demonstra menor infiltração linfocitária, assim como expressão diminuída das citocinas inflamatórias (IFN-gama e TNF), e um aumento na expressão das citocinas inibitórias (IL-4, IL-10, e TGF-beta) (23). Também tem sido descrito que a administração por outra via mucosa, como por exemplo a via nasal, possa também suprimir diabetes em camundongos. Apesar destes achados, mais recentemente, e de modo polêmico, o papel de "proteção" conferido pelas células TH2 através da secreção de suas citocinas inibitórias tem sido questionado neste modelo. Se houver uma secreção preponderante de IL –10 sobre a secreção de IL –4 , é possível que o processo imunológico tome os rumos da autoimunidade com insulinite e fibrose (23,24) . 

Miastenia Gravis (Receptor de acetilcolina)

Embora a miastenia seja uma doença mediada por anticorpos, a administração oral ou nasal do receptor da acetilcolina é capaz de prevenir ou retardar o início desta doença. Neste modelo animal, grandes doses de antígeno são necessárias (25).

Artrite Experimental (Colágeno tipo II)

A administração oral de colágeno tipo II suprime vários modelos animais de artrite. Outros antígenos têm sido descrito na demonstração do efeito da tolerância oral, como o colágeno tipo I e o peptídeo imunodominante do colágeno humano. Os peptídeos do colágeno tipo II podem ser administrados também por via nasal, com boa resposta supressora (26).

Uveoretinite (Antígeno S de retina, IRBP)

A administração do antígeno S ou de seus peptídeos, um autoantígeno retiniano que induz uveíte experimental autoimune, é capaz de prevenir ou diminuir substancialmente o processo ocular inflamatório (27).

Transplantes (aloantígenos, peptídeos do HLA)

Células alogênicas administradas por via oral são capazes de reduzir ou suprimir a rejeição de enxertos de pele e cardíacos. Ademais, estudos alimentando camundongos candidatos a transplante renal com extrato de células renais do animal doador, foi capaz de reduzir importantemente a rejeição renal nos recipientes (28).

Tiroidite autoimune experimental (Tireoglobulina) 

A Tiroidite Autoimune Experimental (TAE) é uma condição induzida através da imunização com tireoglobulina humana (TGh) e adjuvant completo de Freund, produzindo hiperreatividade celular e humoral em raças susceptíveis de camundongos (29). Em certa medida, este modelo representa a tiroidite crônica linfocítica humana (Tiroidite de Hashimoto).

Nós estudamos o fenômeno da tolerância oral neste modelo experimental de tiroidite. Inicialmente, demonstramos supressão da TAE pela admnistração oral de TGh (30). Posteriormente, estendemos estas observações para delinear a natureza das linfocinas e citocinas responsáveis por este processo de imunossupressão (31), trabalho publicado com destaque editorial (32). Nossos animais imunizados com TGh desenvolveram tiroidite histológica com anticorpos anti-TG (IgG, IgA e IgM) e proliferação de linfóctios in vitro. A alimentação com TG resultou em até 80% de supressão destas respostas imunes, quando administrada antes da imunização, e em até 40%, quando administrada depois da imunização. Este fenômeno é antígeno-específico e as células efetoras responsáveis pela supressão pertencem preponderantemente à classe CD8+. Ademais, em resposta à TG in vitro, os linfócitos dos animais tolerantes produziram IL-4 e TGF-b , enquanto os linfócitos dos animais não-tolerantes produziram IL-2 e interferon-gamma. 

Os resultados destas experimentações animais são tão sugestivos que encorajaram o desenvolvimento de estudos de aplicação do processo de tolerância oral no tratamento de doenças auto-imunes em humanos. Presentemente, a administração oral de Colágeno tipo II de galinha, de Antígeno S de retina, de proteína básica da mielina bovina, de insulina e de extrato dissecado de tiróide estão sendo estudadas em um esforço para suprimir a autorreatividade em pacientes com Artrite Reumatóide (8), Uveoretinite (9) Esclerose Múltipla (10), Diabetes (11) e Tiroidite de Hashimoto (33) , respectivamente.

Tratamento de Doenças Autoimunes usando a Tolerância Oral em Humanos.

Um estudo aberto foi realizado em dois pacientes com Uveoretinite Autoimune (9). Os pacientes estavam sob o uso de drogas imunossupressoras, como corticóide e/ou ciclosporina, para manutenção da acuidade visual. Durante a fase de "desmame" das drogas imunossupressoras, doses de 30 mg de Antígeno S de Retina foram administradas 3 vezes por semana. Observou-se boa resposta em ambos os pacientes por um período de dois anos, possibilitando a redução das medicações imunossupressoras sem piora da visão e com diminuição da resposta imune ao antígeno S. Após esta observação preliminar, um estudo duplo-cego com maior número de pacientes foi iniciado e está em andamento. 

Mais recentemente, dois outros estudos em humanos ganharam destaque na literatura. O primeiro, realizado com 60 pacientes, utilizou cartilagem de esterno de frango para extração de colágeno tipo II, um dos antígenos potencialmente envolvidos na Artrite Reumatóide (8). Os pacientes selecionados não haviam obtido controle da atividade da doença com o uso de medicações imunossupressoras. Estas drogas foram, então, retiradas e os pacientes tratados por um período de 3 meses. O tratamento consistiu de 100 ug/dia de colágeno tipo II no primeiro mês e de 500 ug/dia nos dois meses subsequentes. Ao final, observou-se redução da resposta inflamatória nas articulações envolvidas, assim como diminuição, laboratorialmente comprovada, no grau de atividade da doença. À luz dos conhecimentos atuais sobre tolerância oral, este estudo não define o colágeno tipo II como o responsável pela doença, mas como as doses administradas são consideradas pequenas, é possivel que o efeito de tolerância imunológica possa ter sido mediado por células reguladoras, que teriam migrado para a articulação e liberado citocinas inibidoras, como TGF-beta e IL-4, promovendo o efeito anti-inflamatório.

O segundo estudo envolveu 15 pacientes portadores de Esclerose Múltipla com surtos remitentes da doença (10). Estes pacientes ingeriram cápsula contendo 300 mg de PBM ou placebo por dia, durante um ano. Os resultados demonstraram diminuição da resposta linfoproliferativa nos pacientes tomando o antígeno, quando comparados com os do grupo placebo. Do ponto de vista clínico, observou-se que 12 dos 15 pacientes tomando placebo apresentaram surtos de intensa atividade da doença, contra 6 dos 15 que haviam ingerido o antígeno. Embora estes resultados sejam promissores, devido ao pequeno número de pacientes, um novo estudo duplo-cego multicêntrico com 300 casos de Esclerose Múltipla está em desenvolvimento.

O trabalho mais recente sobre o assunto se refere ao tratamento com extrato tiroideano em pacientes portadores de autoimunidade tiroideana (33). Treze pacientes foram oralmente tolerizados por um ano, ao final do qual observou-se apenas supressão da imunidade celular e não da humoral. Possívelmente, as doses administradas tenham sido muito baixas para a obtenção da imunossupressão combinada. Os estudos estão em continuação, utilizando-se, agora, doses diferentes e mais altas.

Finalmente, está se iniciando o primeiro trial em pacientes com Diabetes Mellitus tipo I ou portadores de anticorpos positivos sem doença estabelecida, utlizando-se insulina humana e outros antígenos celulares mais específicos, como o GAD e seus peptídeos. Serão estudados tanto os casos de diagnóstico recente, como os aspectos de prevenção da doença em parentes susceptíveis.

No momento, a maior parte dos estudos clínicos se encontra em fases I e II de experimentação, englobando ainda um número pequeno de pacientes. O endosso a esta modalidade terapêutica aguarda resultados de testes da fase III, que compreende estudos em grande escala e que já se encontram em andamento para Artrite Reumatóide e Diabetes Mellitus tipo I.

Considerações finais

Embora pareça claro em animais e em seres humanos que antígenos orais possam suprimir a autoimunidade, os mecanismos imunológicos responsáveis por este fenômeno ainda precisam ser melhor delineados e compreendidos. O fato de que mecanismos diferentes podem levar à indução de tolerância oral é relevante, tanto do ponto de vista científico como do ponto de vista clínico. Para que a indução de tolerância oral possa ser usada na prática médica diária como forma de tratamento de doenças autoimunes, é importante que o mecanismo predominantemente induzido seja o de supressão ativa. 

Se o mecanismo de indução da tolerância for anergia ou deleção clonal de células auto-reativas, isto obrigaria o clínico a determinar o antígeno-alvo envolvido na auto-agressão, para cada paciente. Se, no entanto, o mecanismo principal de indução de tolerância for mediado por "células supressoras", a determinação do alvo exato torna-se desnecessária. Assim, a despeito das células reguladoras serem antígeno-específicas, os métodos que elas utilizam para induzir a supressão são antígeno-inespecíficos, através da secreção de citocinas inibitórias. O único requisito é que elas reconheçam um antígeno que esteja presente no orgão-alvo do processo auto-imune. Uma vez induzidas, as células reguladoras migrariam para o orgão-alvo, onde, na presença de qualquer dos antígenos reconhecidos por elas (por exemplo, a tireoglobulina), iniciariam a liberação de citocinas com ação anti-inflamatória (TGF-B, IL-4). Estas substâncias, atuando de maneira parácrina e antígeno-inespecíifica, inibiriam a inflamação induzida por quaisquer outras células presentes no mesmo microambiente. O fato de que estas citocinas atuam independentemente da especificidade antigênica permitiria, em tese, que se utilizasse um único antígeno para o tratamento de qualquer doença auto-imune do mesmo orgão.

Assim, o mecanismo de "supressão ativa bystander" resolveria o maior problema relacionado à terapia célula T-específica de doenças inflamatórias autoimunes, pois torna desnecessária a identificação do antígeno determinante da autoimunidade, ou de seus epítopos antigênicos, para que a tolerância oral seja efetiva.

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