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A -ETAPAS DE DESENVOLVIMENTO DO BIOFILME

Um biofilme maduro pode levar de algumas horas até várias semanas  para desenvolver-se , dependendo das condições de seu meio ambiente.

1-CONDICIONAMENTO DA SUPERFÍCIE

Quase imediatamente após a água entrar em contato com uma superfície lisa e limpa , moléculas orgânicas aderem a esta superfície e neutralizam a carga de superfície que pode repelir alguma bactéria  que  procure aproximar-se.

2-ADESÃO DE BACTÉRIA "PIONEIRA"

Bactéria planctônica , que flutua livremente na água , primeiro adere por fôrças eletrostáticas e forças físicas.Algumas destas células irão aderir  de forma permanente por suas substâncias poliméricas extracelulares.Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria "pioneira" que pode aderir a aço inoxidável , mesmo superfícies eletropolidas , dentro de 30 segundos de exposição.

3-FORMAÇÃO DA PELÍCULA

Os polímeros extracelulares são grupos de polissacarídios com carga ou neutros que não somente "colam " a célula à parede da tubulação , mas também atuam como sistemas trocadores de ions , para captura e concentração de nutrientes da água. À medida que os nutrientes se acumulam , as células pioneiras se reproduzem. Assim rapidamente uma colônia se estabelece . Um biofilme maduro tem de 75% a 95% de seu volume ocupado por matriz de polissacarídios  e água. Este conteúdo aquoso torna o biofilme com aspecto gelatinoso e escorregadio.

4-COLONIZADORES SECUNDÁRIOS

A rede de polímeros capta outras células e seus resíduos , agregando mais volume ao biofilme.

5- O BIOFILME FUNCIONANDO

Um biofilme maduro , completo , atua como se um tecido vivo existisse na superfície interna de uma tubulação , ou , à semelhança de um um  endotélio vascular ! O biofilme é uma comunidade complexa , metabolicamente cooperativa , construída  por espécies diferentes , cada uma vivendo em um micro-nicho. Imagens de biofilmes , captadas através Microscopia Eletrônica , são mostradas na Figura VI.

Uma camada anaeróbica pode desenvolver-se sob o biofilme aeróbico.Quando a película do biofilme cresce até uma espessura que lhe permita estender-se para zonas de fluxo mais turbulento , algumas células desprendem-se e , como sementes , vão colonizar sítios adiante da tubulação.

FIGURA VI - Imagens de bactérias e matriz de biofilme, captadas através Microscopia Eletrônica.

B-FATORES PARA DESENVOLVIMENTO DO BIOFILME

GENÉTICA e RESISTÊNCIA

Enquanto as bactérias do biofilme possuem a mesma origem genética daquelas que "flutuam " na água , suas bioquímicas diferem em 40% , o que torna as bactérias do biofilme mais difíceis de eliminar , pela maior resistência a produtos químicos que adquirem com esta alteração( 61 ).

                                      MATERIAL DE SUPERFÍCIE

O material de superfície tem pouca ou nenhuma importância para o maior ou menor desenvolvimento do biofilme.As bactérias aderem ao aço inoxidável ou ao plástico com igual entusiasmo.Superfícies mais lisas retardam um pouco a adesão , mas não interferem com o volume final do biofilme.

                                      ÁREA

Já a dimensão , a área , é um fator primário dos mais importantes. Os sistemas de circulação de água em Hemodiálise oferecem uma enorme superfície para implantação de bactérias.Tanto as resinas e carvão ativado do pré-tratamento , como as membranas de osmose reversa , os tanques de depósito de água já tratada , os filtros e a própria tubulação que distribui a água fornecem notáveis superfícies para adesão e crescimento bacteriano.

                            VELOCIDADE DE FLUXO

Um alto fluxo não evita a adesão bacteriana e nem remove um biofilme já estabelecido. Em qualquer velocidade da água , ela é muito  mais lenta na zona adjacente à superfície , caindo a zero na parede. A distância da parede da tubulação até o ponto em em que o fluxo da água não é turbulento é  chamada de subcamada laminar.Esta distância pode ser considerada igual ao máximo de espessura que o biofilme pode alcançar.

                            NUTRIÇÃO

Como qualquer ser vivo , as bactérias requerem  certos nutrientes para crescer e se desenvolver. A simples limitação destes nutrientes limita o crescimento bacteriano,  porém mínimas concentrações de matéria orgânica são capazes de nutrir enorme volume de bactérias. Teoricamente apenas 1 ppb de matéria orgânica é capaz de produzir 9500 bactérias por ml ! A tecnologia atual não consegue eliminar os nutrientes completamente.Assim , não é possível controlar o crescimento bacteriano pelo controle de nutrientes. Igualmente , mínimos volumes de oxigênio podem gerar um luxurioso crescimento bacteriano.

Embora ainda contenha bactérias , a água ultra-pura ,obtida  por osmose reversa(65 ) , por ter  mínimos nutrientes , irá desenvolver bem menos biofilme que água tratada de modo convencional.

         C- A EVOLUÇÃO DO BIOFILME

As bactérias constituem uma forma de vida de muito sucesso.Em sua evolução desenvolvem estratégias de sobrevivência que incluem adesão e formação de biofilmes , tendo um comportamento muito diferente do adotado por bactérias que se movem livremente na água.

A espessura do biofilme é  dependente da velocidade da água e dos nutrientes. Quando o biofilme cresce , células isoladas ou grumos de células são descoladas de modo aleatório , permitindo flutuações do número de bactérias num mesmo dia , com resultados aparentemente conflitantes.

Uma vez instalado , o biofilme gera bactérias com maior resitência a biocidas , devido à produção de uma secreção viscosa , como um limo , mas muito resistente a produtos químicos usados em desinfecção.Tais produtos não são capazes de atingir as bactérias sob o biofilme.A colonização não só sobrevive como continuamente libera endotoxinas para a água..   

Como recentes estudos vinculam a contaminação bacteriana do dialisato com um estado de inflamação crônica , toda atenção tem sido dirigida para eliminar biofilmes ( 62 ) . A eficácia  de diferentes produtos químicos para eliminar bactérias ,foi testada por Vincent (64  ), que observou uma menor atividade de hipoclorito de sódio,  formaldeído e peróxido de hidrogênio em presença de biofilmes do que em estudos estáticos , na eliminação de bactérias.

 Quando bactérias multiplicam-se numa solução,como concentrado de bicarbonato,  proporcionalmente também aumenta a concentração de endotoxinas (60 ).Entretanto,  não é surpreendente constatar-se que , na prática , não há correlação entre o número de unidades formadoras de colônias (UFC ) e unidades de endotoxinas( 66 ). Muitas vezes a quantidade de UFC é zero mas há altos níveis de endotoxina , porque a pesquisa de UFC é realizada na água circulante( onde pode haver zero UFC )  e as bactérias estarem contidas no biofilme!E de lá liberarem os seus vários tipos de endotoxina. Assim , ausência de bactérias na água nem sempre  significa boa qualidade de água , do ponto de vista de bio-compatibilidade  e indução de reação inflamatória ( 67 ). Por isso devem ser constantemente monitorados tanto a contagem de UFC como os níveis de endotoxina ( 68 ).

         TABELA II : Tipos de endotoxinas e identificação pelo Teste do LAL

Pela técnica do Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) quantificam-se apenas duas  das

diversas endotoxinas conhecidas : o lipopolissacarídeo e o lipídio A .A rigor , mesmo com um teste de LAL esteja dentro de limites aceitáveis , não há segurança absoluta de que não haja outras endotoxinas bacterianas  sendo liberadas na água, desencadeando toda uma cadeia de reações inflamatórias no paciente. Isso decorre do fato de que o teste do LAL não detecta as outras endotoxinas , como mostrado na Tabela II .Existem outros componentes da parede de bactérias gram-negativas , como peptidioglicans e exotoxina A que podem  estar presentes no dialisato , ser pirogênicos mas não ser detectadas pelo Teste do LAL(71). Também há evidências que todas endotoxinas detém capacidade de indução da reação inflamatória via citocinas (68 ).Em termos práticos, o teste do LAL também se constitui num ótimo marcador para a presença de biofilme . Uma  baixa concentração de UFC  com alto nível de endotoxinas expressa , provavelmente , a presença de biofilme no sistema de circulação de água . Se ambos testes forem concordantes , com alto número de UFC e alto nível de LAL , é muito alta a probabilidade da incômoda presença de biofilme em algum componente do circuito, ou até mesmo em grande extensão do mesmo. A possibilidade  de haver nível zero de endotoxina  na água somente se realiza quando também for zero a quantidade de bactérias tanto na água circulante quanto no biofilme , ou melhor dizendo, não havendo biofilme.

                   UMA NOVA VERSÃO PARA O TESTE DO LAL

Para facilitar a execução do Teste do LAL na própria Unidade ,o fabricante lançou versão mais simplificada , denominada Pyrosate , executável em 60 minutos , permitindo um diagnóstico seguro e rápido. Uma das grandes vantagens de executar o TESTE do LAL na própria Unidade é a precoce identificação do problema(68).Com isso podem ser tomadas providências que limitem o impacto de uma contaminação , como obter amostras de água de pontos suspeitos e testá-las , inclusive durante uma reação aguda , permitindo  que ações corretivas imediatas sejam tomadas com maior grau de certeza. Na FIGURA VII , abaixo , é reproduzida a rotina de execução da nova versão do Teste do LAL , denominado PYROSATE.

MONITORAMENTO BACTERIOLÓGICO

       Recentemente também foi descrito um aperfeiçoamento no monitoramento bacteriológico de água , com uma técnica de cultura específica usando agar com baixos nutrientes e com um tempo médio de incubação de 10 dias ( 70 ).Com esta técnica , chamada Reasoner` 2 A , há maior sensibilidade em demonstrar contaminação bacteriana na água e dialisato do que com o uso de Agar Soja Trypticase ( TSA ) , a  técnica atualmente recomendada pela AAMI.

FIGURA VII: Uma nova versão do Teste do LAL

EVITANDO  O BIOFILME

O desenvolvimento de biofilme pode ser minimizado mantendo-se permanentemente uma velocidade da água no sistema de distribuição  superior a 1,5 metro/segundo ( fluxo turbulento) , bem como evitando-se  estagnação e espaço morto neste segmento (69). Também é crucial uma desinfecção periódica , no mínimo 1 vez ao mês,de toda rede por onde circula água, com produto adequado, incluindo simultaneamente o pré-tratamento ,a Osmose Reversa , os tanques de armazenamento , as conexões às máquinas de hemodiálise, bem como as próprias máquinas .

O uso de água ultra-pura tem sido vinculado à ausência de desenvolvimento de  biofilme , mesmo em segmentos mais vulneráveis do sistema de distribuição de água, desde que também seja submetido a desinfecção regular  ( 65 ).

Também podem ser empregados ÁGUA AQUECIDA A 95º C e OZÔNIO, em sistemas especificamente construídos , alternativas que serão descritas mais adiante.

Para tratar um sistema de distribuição de água já  contaminado com biofilme deve ser feita uma espécie de tratamento de choque , com uso semanal de produto químico em concentração adequada , em toda rede , pelo menos durante 1 mês , até que não haja manifestação clínica aguda ( calafrios , tremores , febre etc.) ou até que a monitorização microbiológica esteja satisfatória , quanto ao número de UFC e teste do LAL.

Uma consideração importante é a de que esquemas de desinfecção prescritos para prevenir infecção não são os mais apropriados para tratar uma contaminação já estabelecida. Idealmente  os esquemas de prevenção deveriam ser aplicados todos os dias , o que é impraticável com produtos químicos.Uma tendência  futura é  o uso de desinfecção "ecologicamente correta" através de ozônio on line , irradiação ultra-violeta e água aquecida  para prevenção de contaminação da rede de distribuição de água tratada.

III- ÁGUA ULTRA-PURA

O termo água ultra-pura refere-se a uma água que não apresente contaminação química , orgânica ou microbiológica (74 ) .A tecnologia moderna de tratamento de água permite a obtenção de um produto com estas condições para emprego na formulação do dialisato e inclusive para soluções de infusão , como para Hemodiafiltração ou Hemofiltração , onde grandes volumes de substituição de ultrafiltrado são empregados.Ocorre que a tecnologia de filtração, isoladamente , não pode garantir uma água microbiologicamente adequada  e de modo permanente. Deve haver também uma incorporação de procedimentos de manutenção apropriados , monitoração , limpeza e sanitização da rede hidráulica. Há uma tendência atual para que este padrão de qualidade também seja incorporado à Hemodiálise (75),sendo este objetivo ,o uso rotineiro de um  dialisato ultra-puro , considerado  recomendável e alcançável (76).

                            PARAMETROS  DE ÁGUA ULTRA-PURA

Os limites para bactérias e endotoxina no dialisato da Association for the Advanced of Medical Instrumentation (AAMI), são datados de 1992 e referem-se à época de recirculação  de dialisato , que atualmente não é mais utilizada .Na Europa os critérios de qualidade do dialisato são bem mais rígidos do que nos Estados Unidos , onde atualmente a legislação tende a ser modificada. A AAMI estuda a possibilidade de reduzir o limite de 2000 UFC/ ml do dialisato para 200 UFC/ml , bem como fixar o nível de endotoxina em 2 UE/ml .Atualmente o nível de endotoxina para dialisato não está especificado pela AAMI.

      Água ultra-pura deve cumprir com a definição a priori  de ser um produto isento de bactéria e produtos derivados de bactérias e sem capacidade indutora de citocinas (75).O seu alto grau de qualidade tem sido desenvolvido para satisfazer as necessidades da indústria de semicondutores.

      Uma forte ênfase é colocada na sua pureza química , devendo alcançar uma resistividade  na faixa de 0,1-0,5 MO/cm , bem como cumprir as estritas recomendações quanto à contaminação bacteriana, com < 0,1 UFC / ml e os quase indetectáveis 0,03 UE/ml de endotoxina , usando o ensaio cromogênico cinético do Limulus amoebocyte lysate (LAL ) ( 75 ).

Este padrão de água ultra-pura  pode ser obtido através Osmose Reversa (OR), usando apenas uma ou mesmo duas unidades de OR  em série  , ultrafiltros apropriados e boas práticas médicas quanto à higienização do circuito da água.

   Um dialisato  produzido com água ultra-pura também deve preencher os requisitos  de qualidade microbiológica de soluções de infusão , devendo ser estéril e não pirogênico. Também não deve ter capacidade de induzir atividade de citocinas.

                Na tabela III é possível comparar diversos parâmetros de qualidade utilizados para  água e dialisato (77 ).

continua

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